Transcripción alternativa:

medi de separació i al damunt la sang 2. Centrifugació durant 20-30min. 1. La polisucurosa (component del medi de separació) causa agregació de les hematies facilitant la sedimentació ràpida 2. Es sedimenta al fons els granulocits a causa d'una densitat mes gran 3. Les cèl·lules mononucleades queden entre el medi i el plasma 3. Aspirar amb pipeta el sobrenedant ( capa de cèl·lules mononuclesdes). Transferiment a un tub net i es renta amb un tampó O solució salina per eliminar restes de plasma i plaquetes. 4. A partir de les cèl·lules renta des es continua amb la extracció d' 2. Cultius cel·lulars Son metodes d'obtancio de cèl·lules ni vitro mitjançant sembres controlades en medis adequats El pretractament consisteix en La recol·lecció de les cèl·lules abans de seguir amb l'extraccio. Situacions que es poden donar : • Cultius en suspensió: si les cèl·lules creixen en suspensió es procedeix a : 1. Recollir en un tub 2. Eliminació del medi amb la centrifugació 3. Rentar les cèl·lules amb el tampó o sèrum fisiològic abans de iniciar l'extraccio i la purificació • Cultius en monocapa: creixement en monocapa adherida a la paret del flasco. - Utilitzar el mateix flasco 1. Retirar el medi del flasco 2. Retirar la monocapa amb tampó o solució salina 3. Iniciacar al mateix flasco L'extraccio - Passar la monocapa a un tub : 1. Desenganxar la monocapa de forma mecànica ( raspador les celules amb solució tripsina 2. Recollir les cèl·lules en un tub 3. Eliminar la tripsina, rentant les cèl·lules 3. Teixits animals o vegetals Es necesari un pretractament previ d'homogeneïtzacio Tractament mecànic o químic per alliberar cèl·lules de un teixit 1. Homogeneïtzació mecànica Consisteix en sotmetre el teixit a una acció trituradora o abrasiva Aquesta pot ser : Homogeneïtzació mecànica manual amb morter Procediment : O mitjançant enzimatics ), incubar 1. Es cobreixen de nitrogen líquid els teixits en el morter evitant la formació de cristalls a les cèl·lules que provocar la lisi cel·lular donant a lloc a la degradació. 2. Conseguir una pols amb el morter i deixar evaporar-se el nitrogen líquid 3. Transferir la pols a un tub Minimitza el problema de la degradació. 2. Incubacio ( 37-56°C 12-24h) 3. Retiracio de la mostra Homogeneïtzació mecànica automatitzada Procediment : 1. Tallament en petits fragments 2. Homogenitzacio per adicio d'agents abrasius i agitació, per esferes de vidre o ceràmica 3. Transferiment a tub net Aquest procediment pot degradar els components 2. Homogeneïtzació química Consisteix en sometre el teixit a l'acció de les proteases i detergents que degraden els compostos titulars. Per a mostres molt petites i talls de teixit en congelació per criostat. Procediment 1. Afegiccio de la mostra la mescla d'incubació que conte les proteases i els detergents per la digestió del teixit Altres mostres Cultius bacteris i llevats 1. Cultius de bacteris i llevats Situar els bacteris i llevats en un tampó de suspensió Situacions segons el medi : Els esputs Cultiu en medi líquid 1. Centrifugar el tub per eliminar el medi de cultiu sobrenadant 2. El sediment es ressuspèn en el tampó de suspensió 2. Cèl·lules de la mucosa oral. La lisis cel·lular Per alliberar els àcids Sistemes d'obtencio: Raspat • Esbandida • Recull de saliva directe 3. Esput Detecció de presencia de microorganismes patogens causants d'infeccions respiratòries 2. Extracció d'àcids nucleics Disposarem de la suspensió cel·lular procariota o eucariota a partir de la qual durem a terme L'extraccio. L'extraccio: implica principalment dos processos la inactivació de nucleases cel·lulars Per evitar la degradació Colònies aïllades sobre un medi sòlid ( placa d'agar ) 1. Recolliment de la colònia 3. Resuspensio de la colònia en el tampó de suspensió cèl·lules de la mucosa oral Detergents Per trencar la bicapa lipidica, el SDS es el mes utilitzat 1. La solució de lisi Depèn del tipus de cèl·lula a lisiar pot incloure : Procés d'extraccio: obtenció de un Lisiat el·lular d'aspectes homogeni on els àcids nucleics es troben lliures de les estructures cellulars que els mantenen aïllats. S'aconsegueix en mitjançant la incubacio de la suspensió cel·lular amb una solució de lisi. EDTA Atrapa els cations de magnesi que ha al medi de reacció. Inhibieix L'activitat de les ADNases Agents caotropics Son agents catatropics per a inactivar la RNAases Proteases Digerixen proteines, eliminen nucleases i ajuda a trencar les membranes, les mes utilitzades es la proteinassa K 2. Verificació del resultat de la lisi Cal comprovar que s'ha aconseguit una solució homogènia que indiqui que el procés de lisi cel·lular ha estat eficient Si amb la lisi no es suficient cal prolongar el protocol fins que desapareix quin els grumolls. 3. Consideracions d'extraccio de L'ADN Quan L'ARN pot inferir en els estudis, s'ha de eliminar. Per fer-ho: • Afegiment al medi de reacció ARNasa A. • Incubacio a 37° durant 15-25min 3. Purificació dels àcids nucleics Després de la lisis els àcids es troben inmerses en un extracte cel·lular junt amb proteines, sals, components i reactius. Proces de purificació : separació de els àcids de la resta de components Purificació : en la purificació trobem sis mètodes principals > Solvents orgànics > Salting-out > Cromatogfrafia de intercanvi ionic > Cromatografia de intercanvi ionic > Purificació amb esferes magnètiques > Ultrafiltracio Solvents orgànics : barreja de fenol ( 25 ), cloroform ( 24 ) i alcchol ( 1 ) Al fer la barreja obtindrem dos fases Fase aquosa amb ADN = hidrosoluble Fase orgànica+ Liposoluble = prot + lípids Al obtenir les dues parts ens quedem amb la fase aquosa que transportem a un altre ependorf. S'ha de separar L'ADN de l'aigua: Afegim etanol al 100% en fred per precipitar ( quedant al fons de l'ependorf ) L'ADN • Eliminar el sobrant quedant només L'ADN • Rentem el sobrant amb etanol al 5% per a eliminar substàncies que hagin quedat retingudes ( substàncies orgàniques i restes de etanol) > Congelem el Pelet > Resuspenem amb etanol al 75% Precipitació amb sals o salting-out Afegim a la mostra + solució de lisi la solució salina concentrada que fara precipitar les proteines de manera que s'obtindra una solució aquosa (amb ADN) i un precipitat amb proteines. Ens quedem amb el sobrenadant ( solució aquosa amb ADN) i repetirem els pasos anteriors. Cromatografisa d'absorció Emprem unes columnes envoltat de llana de vidre que impideix l'unio de L'ADN envoltat de molècules d'aigua. Haurem de eliminar les molècules d'aigua per a conseguir l'unio de L'ADN amb la llana de vidre. L'ADN s'unir molècules d'aigua cauran per l'interior de l'ependorf. Per aconseguir el ADN L'hidtratarem fent que les molècules s'adhereixen i causen la separació de L'ADN amb la llana de vidre Cromatografia d'intercanvi ionic Emprem en petits epndorfs amb una obertura amb una columna de sílice o Selu L'OSA amb carrega positiva que farà retenir L'ADN gràcies a la seva carrega negativa. Pasos per obtenir el que necessitem : Omplim la columna amb silici + •Tot el que tengui carrega negativa queda enganxat a la columna i la resta surt per la part inferior Es renta la columna amb tampons de concentració salina creixent per eliminar comenta infants amb carrega negativa • Es renta amb tampó de màx. Salinitat per precipitar L'ADN i es recull en un ependorfv Es precipita L'ADN amb etanol 100% es renta amb etanol 75% es resuspen en tampó TE Mostra solució de lis Etanol al Rentem per eliminar impureset -Agent caotropic ADN queda a la columna selminen les proteines components cel·lulare. Rentem amb H₂0 tampó TE. el APN al hidratar-se es desengantxacau. - Purificació amb esferes magnètiques Semblat al mètode anterior, afegim agent caotropic per eliminar l'H20 que envolta L'ADN Afegir el lisat+ L'agent caotropic + esferes magnètiques Posar el tub en un suport amb un. Iman que atreure les boles magnétiques amb L'ADN i eliminar la resta a traves de el piprteig • Es renta amb alchol de 70 % i tornem a resuspendre amb aigua o tampó TE per a que L'ADN tornin a tenir una capa d'aigua fent que es desengany i de les esferes Activem l'iman, L'ADN es desengntxa i el extreiem pipetet jant Continuació • Consideracions especials 1. Purificació de ADN plasmidi Per a la separació de aque ✓ prin plasmidis : Mètode de separació per lisi al Alcalina (Lisi amb pH basic) SDS+NaOH = Lisi de bacteries i desnaturalització de L'ADN AON Plasmatic de ADN ·Agregats A continuació obtenim: ADN plasmidis, agregats de ADn+Proteines. M es fa d'algún mètode l'extraccio proteines - Ultra filtració: es sol emprar per purificar productes de PCR amb mides Per a eliminar els primers i els nucleotids farem passar unes columnes amb uns porus que impideix l'entrada de altres materials que no sigui ADN. Una vegada retingut L'ADN traspàs em a l'ependorf i rentem i resuspenem L'ADN - Integritat - Puresa - Concentracoi Afegim àcid potàssic amb pH 4'8 - Renaturalitazio ràpida - L'ADN cromosòmics es renaturalitzar malament en forma de agregats i els plasmidis ho fan bé al ser mes petit Precaucions al treballar - En cabina de fluxe laminar - Netejar la superfície i utensilis amb inactiva dors de ARNases - Reactius i aigua lliures de ARNases - Solució de lisis afegir ionitzants de guanidina ( inhibidor de ARNases ) 4. Qualitat de les àcids nucleics • Bona integritat 1 • Parcialment degradat2 • Smear o Totalment degradat 3 1. La integritat L'objectiu de la integritat es comprovar si l'àcid nucleics conserva la mida original o si se ha degradat o fragmentat. Com mes llarg i menys fragmentat millor. Com s'aconsegueix la conservació de el àcid nucleics : Amb el gel de garosa podem veure si es Es realitza mitjançant la electroforesis en gel agarosa o'7 1'2 % ADN : Si observem Smear vol dir que la mostra esta molt degradada. ADN plasmidis : lo habitual es trobar una banda, si trobem dos son dimers units entre ells ARN Trobem diferents bandes corresponents als diferents tipus de ARN 2. Puresa Objectiu es determinar si se observen possibles contaminants com les proteines, sals, reactius.. Si les observem haurem de tornar a rentar la mostra. En aquesta tècnica s'utilitza un espectrofotomotre. A quatre valors que mirarem al espectofotometre. Absorvencies : • A260 : Àcids nucleics • A280: Proteines i derivats fenols • A230 Carbohidrats i sals A320 Turbidesa = partícules en suspensió Abans de de fer els càlculs se ha de restar La Abs360 a tot A260 A 280 A260 A230 Valor ideal Exemple Si ≤ 16 Si >2 Valor ideal 21'5 117-2 Per 11 18-211 Per ARN Contaminació per proteines o fenol tornar a purificar o tractar amb proteinassa K contaminació elevada d'ARN (tractar amb ARNases) 1'5-2'2 Presencia de contaminants. (tornarem a rentar amb etanol) 3. Concentració (A260- A30) x factor dilació x Factor conversio ✓ ADNnds = x 50 ns /ul ADN ss = x 33 ns/vl 1RN = x Yons / ml 91 X pagina (0'326-0¹006) x 50 (dilució emprada (0) 50 Jo tinc l'ADN resuspes en 100ml de tampo, per tant 4. Emagatzematge de els àcids nucleics Es conserven en ependorfs o criotubs lliures de nucleases S'emmagatzema en fred: (factor conversio) = 800 ns/ml tinc 800 ns/e. 100 ml = 80.000ng • ADN: 4-5 dies en nevera i de 5 dies en congelador • ARN : temps curts ( dies ) a -20°C i temps llargs (mesos ) a -80°C